images38

TUJUAN

Tujuan praktikum yaitu untuk mengisolasi DNA plasmid pGem 3 zf dari bakteri E.coli dan menghitung konsentrasi DNA plasmid tersebut dengan menggunakan alat spektrofotometer UV.

Bakteri E. Coli yang digunakan dalam transformasi gen atau lebih dikenal dengan istilah kloning gen, pada awalnya hanya mempunyai satu macam untaian DNA atau kromosom (kromosom genomik atau kromosom utama). Setelah ditransformasi dengan DNA plasmid rekombinan , maka bakteri tersebut mempunyai dua macam DNA yaitu kromosm genomik dan ekstra kromosom (DNA plasmid) yang mempunyai karakter yang berbeda. Untuk dapat mengisolasi kedua macam DNA tersebut digunakan metode yang berbeda. Dalam praktikum akan diisolasi DNA plasmid dengan mengunakan metode mini prep yaitu metode isolasi plasmid pada skala kecil.

DNA rekombinan dibuat dengan cara sebagai berikut : Sepotong DNA dari organisme yang diminati, disambungkan ke dalam atau ke suatu plasmida ataupun pemakan bakteri lamda (disebut wahana atau vektor) dan molekul kimerik yang dihasilkan, masing-masing berturut-turut digunakan untuk mentransformasikan atau menginjeksi sel bakteri inang. Bakteri inang biasanya merupakan suatu galur khas E.coli yang tidak mampu memperbanyak diri tanpa kondisi biakan yang khusus.

Agar sepotong DNA dapat diklonkan untuk penelitian, lebih dahulu DNA itu harus diikat pada suatu wahana kloning atau vektor. Salah satu tipe wahana kloning yang digunakan untuk percobaan ini adalah plasmid. DNA disambungkan pada DNA plasmid dan molekul kimeriknya digunakan untuk mengubah bentuk bakteri inang seperti E. Coli. Kemudian plasmid mengadakan replikasi dalam inang, sewaktu inang tumbuh dan membelah, dan potongan DNA yang diinginkan terklonkan.
Plasmida adalah unsur genetik di luar kromosom (ekstrakromosoma) yang mengadakan replikasi secara autonom di dalam sel bakteri. DNA-nya berbentuk lingkaran dan beruntai ganda. Dan plasmida itu mendukung gen yang diperlukan baik untuk replikasi plasmida maupun untuk fungsi lain. Umumnya wahana plasmida mempunya densitas apungan berlainan daripada DNA inang dan dengan mudah dapat dimurnikan. Beberapa plasmida memiliki beberapa kemampuan untuk berintegrasi ke dalam kromosom inang, dan plasmida ini disebut episom.
Setelah ditransformasi dengan DNA plasmid rekombinan, maka bakteri tersebut mempunyai dua macam DNA yaitu kromosom genomik dan ekstra kromosom (DNA plasmid) yang mempunyai karakter yang berbeda. Untuk dapat mengisolasi kedua macam DNA tersebut digunakan metode yang berbeda. Dalam praktikum akan diisolasi DNA plasmid dengan menggunakan metode mini prep, yaitu metode isolasi plasmid dalam skala kecil.Dalam sel bakteri, plasmida tunggal mampu memperbanyak diri untuk menghasilkan keturunan yang identik. Jika suatu plasmida mengandung gen manusia, maka kemudian gen itu ikut dibuat duplikatnya bersama molekul-molekul lain yang dikandungnya. Mengingat bakteri yang mengandung plasmida juga tumbuh dan membelah diri dengan kecepatan sekali setiap 20 menit, masing-masing sel anakan membawa bersamanya sedikit plasmida, yang kemudian memperbanyak diri lagi. Dengan cara demikian, dari satu bakteri dalam waktu singkat akan menghasilkan berjuta-juta keturunan.

ALAT DAN BAHAN

1. Mikropipet
2. Mikrosentrifugasi berpendingin
3. Tabung mikrosentrifugasi
4. Spektrofotometer
5. Media LB cair
6. Larutan I yang terdiri dari :
• 25 mM Tris-HCl pH 8,0
• 50 mM Glukosa
• 10 mM EDTA
7. Larutan enzim lisosim yang dilarutkan dengan larutan (8 mg/mL).
8. Isopropanol
9. Larutan II yang terdiri dari :
• 0,2 N NaOH
• 1% SDS (Sodium dedocyl sulphate)
• Larutan II harus dibuat dari larutan stok : 10 N NaOH dan 20% SDS, dan disimpan pada suhu ruang
10. Larutan III (Larutan potassium asetat dilarutkan dengan 11,5 mL asam asetat glacial, kemudian tambahkan akuades sampai 100 mL. Simpan dalam lemari es.

CARA KERJA

1. 1,5 mL kultur bakteri
2. Sentifuse pada 10.000 rpm, 40C, 5 menit
3. Buang supernatan, + 1,5 mL kultur bakteri,
4. sentifuse pada 5000 rpm, 40C, 5 menit
5. Buang supernatan, suspensi pellet dgn 100 mikroLiter larutan I
6. vortex
7. Tambah 25 mikroliter lisozim, inkubasi 37 ‘C, 15 menit
8. Tambah larutan II 400 mikroLiter, bolak balik, masukkan es 10 menit
9. Tambah larutan III 300 mikroLiter, bolak balik, masukkan es 10 menit
10. Sentrifuse 12.000rpm, selama 10 menit
11. Supernatan 800 mikroLiter dipindah ke eppendorf baru + isopropanolol (480L¬)
12. Inkubasi -20’C 15 menit
13. Sentrifuse 12.000 rpm, 15 menit, buang supernatan
14. Cuci pelet dengan 1 mL 70% etanol, sentrifuse
15. Buang supernatan, keringkan pelet dengan pompa vakum
16. Larutkan DNA plasmid dengan 50 mikroLiter buffer TE
17. Ukur tingkat kemurnian dengan spektrofotometer UV