images39

TUJUAN

Dapat mengetahui dan mempraktekan cara memotong DNA dengan enzim endonuklease.

Pada tahun 1960, Werner Arber & Hamilton Smith menemukan enzim dari mikroba yang dapat memotong DNA utas ganda. Enzim tersebut sekarang dikenal dengan enzim restriksi atau endonuklease restriksi. Enzim tersebut mengenal dan memotong DNA pada sekuen spesifik yang panjang 4 sampai dengan 6 pasang basa. Enzim tersebut dikenal dengan enzim restriksi atau enzim endonuklease restriksi.

Secara alami, bakteri menghasilkan enzim restriksi untuk menghancurkan DNA fage yang menginfeksinya (yang masuk ke dalam sel bakteri) Sampai saat ini sudah banyak jenis enzim restriksi yang telah ditemukan dan diisolasi dari berbagai spesies bakteri. Nama setiap enzim restriksi diawali dengan tiga huruf yang menyatakan nama bakteri yang menghasilkan enzim tersebut.
Setiap enzim restriksi mengenal sekuens dan situs pemotongan yang khas. Enzim restriksi memotong DNA bukan pada sembarang tempat, tetapi memotong DNA pada bagian tertentu. Bagian pada DNA yang dikenai aksi pemotongan oleh enzim restriksi ini dinamakan sekuens pengenal. Suatu sekuens pengenal adalah urutan nukleotida (urutan basa) tertentu yang dikenal oleh enzim restriksi sebagai tempat atau bagian yang akan dipotongnya. Enzim retriksi (Endonuklease) adalah enzim yang berasal dari bakteri, yang dapat memotong rantai DNA (double stranded) atau RNA. Dalam bakteri enzim ini berfungsi sebagai perlindungan diri dengan cara memotong DNA pada sisi pemotongan tertentu.
Salah satu contoh enzim retriksi adalah Enzim EcoRI yang telah diisolasi pertama kali oleh Herbert Boyer pada tahun 1969 dari bakteri Escherichia coli. Enzim Ecor! Memotong DNA pada bagian yang urutan basanya adalah GAATTC ( sekuens pengenal bagi EcoRI adalah GAATTC ). Didalam sekuens pengenal tersebut, Enzim EcoRI memotongnya tidak pada sembarang situs tetapi hanya memotong pada bagian atau situs anara G dan A.

Pada DNA utas ganda, sekuens GAATTC ini akan berpasangan dengan sekuens yang sama tetapi berlawanan arah. Enzim EcoRI ini memotong setiap utas dari utas ganda tersebut pada bagian anatara G dan A. Sebagai akibatnya, potongan-potongan atau fragmen-fragmen DNA utas ganda yang dihasilkan akan memliki ujung berutas tunggal. Ujung seperti ini yang dikenal dengan istilah sticky ends atau cohesive ends.

Berikut adalah contoh organisme-organisme penghasil Enzim retriksi
NAMA ENZIM SEKUENS PENGENAL ORGANISME ASAL

EcoRI G AATTC Escherichia coli
HindIII A AGCTT Haemophilus influenzae
HhaI GCG C Haemophilus haemolyticus
TaqI T CGA Thermus aquaticus
BsuRI GG CC Bacillus subtilis
BalI TGG CCA Brevibacterium albidum
NotI GC GGCCGC Nocardia otidis-caviarum
BamHI G GATCC Bacillus amylolyquefaciens
SmaI CCC GGG Serratia marcescens

Berdasarkan cara pemotongannya Enzim retriksi digolongkan menjadi dua :

a. Endonuklease, memtotong nukleotida dari arah dalam
b. Eksonuklease memotong nukleotida hanya pada ujung atau dari arah luar

Endonuklease dapat mengenal urutan atau sekuen nukleotida pendek, antara 4-8 nuklotida, yang sering dikenal dengan restrictionsite atau sisi pemotongan, atau situs pemotongan yang spesifik dan berbeda-beda.

Secara umum berdasarkan hasil pemotongan DNA double strain denagn enzim endonuklease memilik dua bentuk yaitu hasil pemotongan sticky end (ujung runcing dan blund end (ujung tumpul seperti pada skema dibawah ini.

Kemampuan memotong DNA pada sisi spesifik menjadi tonggak penting dalam pengembangan metode manipulasi DNA sekarang ini. Endonuklease restriksi merupakan enzim bakteri yang memotong DNA dupleks pada urutan target spesifik. Enzim ini dapat diperoleh secara komersial dari perusahaan-perusahaan produk bioteknologi. Penamaan enzim restriksi didasarkan pada sistem sederhana yang diusulkan oleh Smith and Nathans. Nama enzim (seperti BamHI, EcoRI) menunjukkan bahwa asal enzim, tetapi tidak menunjukkan informasi spesifisitas pemotongan. Sisi pengenalan enzim restriksi pada umumnya adalah urutan palindromik dengan panjang 4, 5, atau 6 pasang basa (pb) seperti AGCT (untuk AluI), GAATTC (untuk EcoRI), dan lain sebagainya.

Masing-masing enzim restriksi memotong urutan palindrom pada sisi spesifik, dan dua enzim berbeda dapat mempunya urutan pengenalan yang sama, tetapi memotong DNA pada titik berbeda di dalam urutan basa tersebut. Ujung DNA hasil pemotongan enzim restriksi dapat dikelompokkan menjadi tiga ketergori: (1) ujung tumpul, (2) ujung lengkaet 5’ dan (3) ujung lengket 3’.

Agarose gel elektroforesis atau southern analisis digunakan untuk memisahkan fragmen DNA berdasarkan berat molekulnya. Metode ini ditemukan oleh Ed sourthern pada tahun 1975. Metode ini digunakan untuuk mengidentifikasi fragmen DNA yang secara menyeluruh untuk mengetahui DNA sekuen. Sourthern hibridisasi juga disebut sourthern blotting digunakan untuk mengetahui perbandinagn antara genome dari suatu particular organisme dan dengan gen penanda atau gen fragmen (probe). Ini dapat menjelaskan apakah suatu organisme berisi pertikel gen dan mengandung informasi tentang pengorganisasian dan restriction map dari suatu gen.

Langkah-langkah dalam analisis sourthern gen DNA pada organisme dipotong dengan enzim retriksi (endonuklease) menjadi fragmen-framen DNA lalu fragmen DNA tersebut dimasukkan pada gel agarose lalu dilakukan elektroforesis dengan mengalirkan arus listrik dari kutub negative ke positif kemudian hasil pemisahan DNA tersebut didenaturasi dalam suatu alkali dan ditransferkan pada membran nitroselulosa. Pada membrane fragmen DNA telah menjadi single stranded lalu dimasukkan kedalam larutan yang mengandungDNA probe, proses ini disebut DNA hibridisasi dengan kata lain DNA target danDNA probe membentuk suatu ” hybdrid” karena keduanya saling melengkapi sekuen dan juga dapat membentuk ikatan satu sama lain. DNA probe biasanya mengandung pelabelan radioaktif dengan γ- [32P] dan polynucleotide kinase sering dengan pemindahan 5′ phosphate dari probe dengan menggunakan alkaline phosphatase. Setalah itu membrane dicuci untuk menghilangkan ikatan probe yang non spesifik, kemudian dengan memajangkannya pada film sinar X akan terbentuk warna hitam apabila positif terbentuk ikatan antara DNA dan probe. Prose ini disebut autoradiography.
Hal ini dapat digunakan untuk mengidentifikasi ukuran DNA dan sejumlah fragmen gen kromosom dengan kekuatan yang sama dengan fragmen gen yang digunakan oleh probe.

ALAT DAN BAHAN

1. Mikropipet
2. Inkubator
3. Tabung Mikrosentrifuge
4. Chamber Elektroforesis
5. UV Transiluminator
6. DNA plasmid hasil isolasi
7. Enzim EcoR1
8. Air deionizedsteril
9. Buffer (high Salt)
10. Agarose Loading Buffer TBE 1x (Tris-borate-EDTA)
11. Ethidium Bromide (hati-hati dapat bersifat karsinogenik)
12. Marker DNA

CARA KERJA

1. Tambahkan aquades deionized steril sampai volume mencapai 20µl (7,5 µl)
2. Lalu di vortek hingga larutan tercampur dengan baik
3. Inkubasi pada incubator suhu 370 C selam 1 jam